BDDE ક્રોસ-લિંક્ડ ઓટોક્લેવમાં નવી પ્રતિક્રિયા બાય-પ્રોડક્ટ્સની શોધ

Javascript હાલમાં તમારા બ્રાઉઝરમાં અક્ષમ છે.જ્યારે જાવાસ્ક્રિપ્ટ અક્ષમ હોય, ત્યારે આ વેબસાઈટના કેટલાક કાર્યો કામ કરશે નહીં.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, સ્પેન * આ લેખકો પાસે આ કાર્યમાં કેટલીક આંતરદૃષ્ટિ સમાન છે. યોગદાન પૃષ્ઠભૂમિ: હાયલ્યુરોનિક એસિડ (HA) એ કુદરતી રીતે બનતું પોલિસેકરાઇડ છે જેનો ઉપયોગ સૌંદર્યલક્ષી હેતુઓ માટે ત્વચીય ફિલરના ઉત્પાદનમાં થાય છે.માનવ પેશીઓમાં તેનું અર્ધ જીવન કેટલાંક દિવસોનું હોવાથી, HA-આધારિત ત્વચીય ફિલરને શરીરમાં તેમના જીવનને લંબાવવા માટે રાસાયણિક રીતે સંશોધિત કરવામાં આવે છે.કોમર્શિયલ HA-આધારિત ફિલર્સમાં સૌથી સામાન્ય ફેરફાર એ HA સાંકળોને ક્રોસલિંક કરવા માટે ક્રોસલિંકિંગ એજન્ટ તરીકે 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર (BDDE) નો ઉપયોગ છે.અવશેષ અથવા બિનપ્રક્રિયા વિનાના BDDE ને <2 ભાગો પ્રતિ મિલિયન (ppm) પર બિન-ઝેરી ગણવામાં આવે છે;તેથી, દર્દીની સલામતી સુનિશ્ચિત કરવા માટે અંતિમ ત્વચીય ફિલરમાં શેષ BDDE નું પ્રમાણ નક્કી કરવું આવશ્યક છે.સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ: આ અભ્યાસ પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (LC-MS) ને સંયોજિત કરીને આલ્કલાઇન પરિસ્થિતિઓ હેઠળ BDDE અને HA વચ્ચે ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયાના આડપેદાશની શોધ અને લાક્ષણિકતાનું વર્ણન કરે છે.પરિણામો: વિવિધ વિશ્લેષણો પછી, એવું જાણવા મળ્યું કે HA-BDDE હાઇડ્રોજેલને જંતુમુક્ત કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી આલ્કલાઇન પરિસ્થિતિઓ અને ઉચ્ચ તાપમાને આ નવા ઉપ-ઉત્પાદન, "પ્રોપીલીન ગ્લાયકોલ-જેવા" સંયોજનની રચનાને પ્રોત્સાહન આપ્યું.LC-MS પૃથ્થકરણે પુષ્ટિ કરી છે કે આડપેદાશમાં BDDE જેટલો જ મોનોઈસોટોપિક માસ છે, અલગ રીટેન્શન ટાઈમ (tR), અને અલગ UV શોષક (λ=200 nm) મોડ છે.BDDE થી વિપરીત, LC-MS પૃથ્થકરણમાં તે જોવામાં આવ્યું હતું કે સમાન માપન શરતો હેઠળ, આ ઉપ-ઉત્પાદન 200 nm પર વધુ શોધ દર ધરાવે છે.નિષ્કર્ષ: આ પરિણામો સૂચવે છે કે આ નવા સંયોજનની રચનામાં કોઈ ઇપોક્સાઇડ નથી.વાણિજ્યિક હેતુઓ માટે HA-BDDE હાઇડ્રોજેલ (HA ડર્મલ ફિલર) ના ઉત્પાદનમાં જોવા મળતા આ નવા આડપેદાશના જોખમનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે ચર્ચા ખુલ્લી છે.કીવર્ડ્સ: હાયલ્યુરોનિક એસિડ, એચએ ડર્મલ ફિલર, ક્રોસ-લિંક્ડ હાયલ્યુરોનિક એસિડ, BDDE, LC-MS વિશ્લેષણ, BDDE બાય-પ્રોડક્ટ.
હાયલ્યુરોનિક એસિડ (HA) પર આધારિત ફિલર્સ કોસ્મેટિક હેતુઓ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સૌથી સામાન્ય અને લોકપ્રિય ત્વચીય ફિલર છે.1 આ ત્વચીય ફિલર હાઇડ્રોજેલ છે, જે સામાન્ય રીતે >95% પાણી અને 0.5-3% HA થી બનેલું છે, જે તેમને જેલ જેવું માળખું આપે છે.2 HA એ પોલિસેકરાઇડ છે અને કરોડરજ્જુના બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સનો મુખ્ય ઘટક છે.ઘટકોમાંથી એક.તેમાં (1,4)-ગ્લુકોરોનિક એસિડ-β (1,3)-N-એસિટિલગ્લુકોસામાઇન (GlcNAc) પુનરાવર્તિત ડિસેકરાઇડ એકમો છે જે ગ્લાયકોસિડિક બોન્ડ્સ દ્વારા જોડાયેલા છે.આ ડિસકેરાઇડ પેટર્ન તમામ જીવોમાં સમાન છે.કેટલાક પ્રોટીન-આધારિત ફિલર્સ (જેમ કે કોલેજન) ની સરખામણીમાં, આ ગુણધર્મ HA ને અત્યંત જૈવ સુસંગત પરમાણુ બનાવે છે.આ ફિલર્સ એમિનો એસિડ ક્રમની વિશિષ્ટતા પ્રદર્શિત કરી શકે છે જે દર્દીની રોગપ્રતિકારક શક્તિ દ્વારા ઓળખી શકાય છે.
જ્યારે ત્વચીય ફિલર તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, ત્યારે HA ની મુખ્ય મર્યાદા હાયલ્યુરોનિડેસિસ નામના ઉત્સેચકોના ચોક્કસ પરિવારની હાજરીને કારણે પેશીઓની અંદર તેનું ઝડપી ટર્નઓવર છે.અત્યાર સુધી, પેશીઓમાં HA નું અર્ધ જીવન વધારવા માટે HA ની રચનામાં કેટલાક રાસાયણિક ફેરફારોનું વર્ણન કરવામાં આવ્યું છે.3 આમાંના મોટાભાગના ફેરફારો HA સાંકળોને ક્રોસ-લિંક કરીને પોલિસેકરાઇડ પોલિમરમાં હાયલ્યુરોનિડેઝની ઍક્સેસ ઘટાડવાનો પ્રયાસ કરે છે.તેથી, એચએ સ્ટ્રક્ચર અને ક્રોસ-લિંકિંગ એજન્ટ વચ્ચેના પુલ અને આંતરમોલેક્યુલર સહસંયોજક બોન્ડની રચનાને કારણે, ક્રોસ-લિંક્ડ એચએ હાઇડ્રોજેલ કુદરતી HA કરતાં વધુ એન્ટિ-એન્ઝાઇમ ડિગ્રેડેશન પ્રોડક્ટ્સનું ઉત્પાદન કરે છે.4-6
અત્યાર સુધી, ક્રોસલિંક્ડ HA ઉત્પન્ન કરવા માટે વપરાતા રાસાયણિક ક્રોસલિંકિંગ એજન્ટોમાં મેથાક્રાયલામાઇડ, 7 હાઇડ્રેઝાઇડ, 8 કાર્બોડીમાઇડ, 9 ડિવિનાઇલ સલ્ફોન, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડીલ ઇથર (BDDE) અને પોલી (ઇથિલિન ગ્લાયકોલ) ડિગ્લાઇસિડિલ ઇથરનો સમાવેશ થાય છે.10,11 BDDE હાલમાં સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતું ક્રોસલિંકિંગ એજન્ટ છે.જો કે આ પ્રકારના હાઇડ્રોજેલ્સ દાયકાઓથી સુરક્ષિત હોવાનું સાબિત થયું છે, ક્રોસલિંકીંગ એજન્ટો ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રતિક્રિયાશીલ રીએજન્ટ છે જે સાયટોટોક્સિક અને કેટલાક કિસ્સાઓમાં મ્યુટેજેનિક હોઈ શકે છે.12 તેથી, અંતિમ હાઇડ્રોજેલમાં તેમની અવશેષ સામગ્રી ઊંચી હોવી જોઈએ.જ્યારે અવશેષ સાંદ્રતા 2 ભાગ પ્રતિ મિલિયન (ppm) કરતાં ઓછી હોય ત્યારે BDDE સલામત ગણવામાં આવે છે.4
ઓછી-અવશેષ BDDE સાંદ્રતા, ક્રોસ-લિંકિંગ ડિગ્રી અને HA હાઇડ્રોજેલ્સમાં અવેજી સ્થિતિ શોધવા માટેની ઘણી પદ્ધતિઓ છે, જેમ કે ગેસ ક્રોમેટોગ્રાફી, માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS), ન્યુક્લિયર મેગ્નેટિક રેઝોનન્સ (NMR) ફ્લોરોસેન્સ માપન પદ્ધતિઓ, અને ડાયોડ એરે જોડી ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી (HPLC).13-17 આ અભ્યાસ આલ્કલાઇન પરિસ્થિતિઓમાં BDDE અને HA ની પ્રતિક્રિયા દ્વારા ઉત્પાદિત અંતિમ ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલમાં બાય-પ્રોડક્ટની શોધ અને લાક્ષણિકતાનું વર્ણન કરે છે.HPLC અને લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી-માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (LC-MS વિશ્લેષણ).BDDE ના આ ઉપ-ઉત્પાદનનું ઝેરીપણું અજ્ઞાત હોવાથી, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તેના અવશેષોનું પ્રમાણીકરણ સામાન્ય રીતે અંતિમ ઉત્પાદનમાં BDDE પર કરવામાં આવતી પદ્ધતિની સમાન રીતે નક્કી કરવું જોઈએ.
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) ના મેળવેલ સોડિયમ સોલ્ટનું મોલેક્યુલર વજન ~1,368,000 Da (લોરેન્ટ પદ્ધતિ) 18 છે અને આંતરિક સ્નિગ્ધતા 2.20 m3/kg છે.ક્રોસલિંકિંગ પ્રતિક્રિયા માટે, BDDE (≥95%) સિગ્મા-આલ્ડ્રિચ કંપની (સેન્ટ લૂઇસ, MO, USA) પાસેથી ખરીદવામાં આવી હતી.pH 7.4 સાથે ફોસ્ફેટ બફર કરેલ ખારા સિગ્મા-એલ્ડ્રીચ કંપની પાસેથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા.LC-MS પૃથ્થકરણમાં વપરાતા તમામ સોલવન્ટ્સ, એસેટોનાઈટ્રાઈલ અને પાણી HPLC ગ્રેડ ગુણવત્તામાંથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા.ફોર્મિક એસિડ (98%) રીએજન્ટ ગ્રેડ તરીકે ખરીદવામાં આવે છે.
બધા પ્રયોગો UPLC એકવીટી સિસ્ટમ (વોટર્સ, મિલફોર્ડ, MA, USA) પર કરવામાં આવ્યા હતા અને ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનાઇઝેશન સ્ત્રોત (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) થી સજ્જ API 3000 ટ્રિપલ ક્વાડ્રપોલ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર સાથે જોડાયેલા હતા.
ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ્સનું સંશ્લેષણ 1% અલ્કલી (સોડિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ, NaOH) ની હાજરીમાં 10% (w/w) સોડિયમ હાયલ્યુરોનેટ (NaHA) દ્રાવણમાં 198 mg BDDE ઉમેરીને શરૂ કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં અંતિમ BDDE સાંદ્રતા 9.9 mg/mL (0.049 mM) હતી.પછી, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને સારી રીતે મિશ્રિત અને એકરૂપ કરવામાં આવ્યું અને તેને 4 કલાક માટે 45°C પર આગળ વધવા દેવામાં આવ્યું.19 પ્રતિક્રિયાનું pH ~12 પર જાળવવામાં આવે છે.
ત્યારબાદ, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ પાણીથી ધોવાઇ ગયું, અને અંતિમ HA-BDDE હાઇડ્રોજેલને 10 થી 25 mg/mL ની HA સાંદ્રતા અને 7.4 નું અંતિમ pH હાંસલ કરવા માટે PBS બફર સાથે ફિલ્ટર અને પાતળું કરવામાં આવ્યું.ઉત્પાદિત ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ્સને જંતુરહિત કરવા માટે, આ તમામ હાઇડ્રોજેલ્સ ઓટોક્લેવ્ડ છે (20 મિનિટ માટે 120°C).શુદ્ધ BDDE-HA હાઇડ્રોજેલ વિશ્લેષણ સુધી 4°C પર સંગ્રહિત થાય છે.
ક્રોસ-લિંક્ડ HA પ્રોડક્ટમાં હાજર BDDEનું પૃથ્થકરણ કરવા માટે, 240 મિલિગ્રામ નમૂનાનું વજન કરવામાં આવ્યું હતું અને તેને કેન્દ્રના છિદ્રમાં દાખલ કરવામાં આવ્યું હતું (Microcon®; મર્ક મિલિપોર, બિલેરિકા, MA, USA; વોલ્યુમ 0.5 mL) અને ઓરડાના તાપમાને 10,000 rpm પર સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું. 10 મિનિટ.કુલ 20 µL પુલ-ડાઉન પ્રવાહી એકત્રિત અને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
આલ્કલાઇન પરિસ્થિતિઓ (1%, 0.1% અને 0.01% NaOH) હેઠળ BDDE સ્ટાન્ડર્ડ (સિગ્મા-એલ્ડ્રિક કો) નું વિશ્લેષણ કરવા માટે, જો નીચેની શરતો પૂરી થાય છે, તો પ્રવાહી નમૂના 1:10, 1:100 અથવા વધુ છે. 1:1,000,000 જો જરૂરી હોય તો, વિશ્લેષણ માટે MilliQ ડીયોનાઇઝ્ડ પાણીનો ઉપયોગ કરો.
ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયામાં વપરાતી પ્રારંભિક સામગ્રી માટે (HA 2%, H2O, 1% NaOH, અને 0.049 mM BDDE), આ સામગ્રીઓમાંથી તૈયાર કરવામાં આવેલા દરેક નમૂનાનું 1 mL સમાન વિશ્લેષણ શરતોનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
આયન નકશામાં દેખાતા શિખરોની વિશિષ્ટતા નક્કી કરવા માટે, 100 ppb BDDE સ્ટાન્ડર્ડ સોલ્યુશન (Sigma-Aldrich Co) નું 10 µL 20 µL નમૂનામાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.આ કિસ્સામાં, દરેક નમૂનામાં ધોરણની અંતિમ સાંદ્રતા 37 ppb છે.
પ્રથમ, 10 μL પ્રમાણભૂત BDDE (Sigma-Aldrich Co) ને 990 μL MilliQ પાણી (ઘનતા 1.1 g/mL) સાથે પાતળું કરીને 11,000 mg/L (11,000 ppm) ની સાંદ્રતા સાથે BDDE સ્ટોક સોલ્યુશન તૈયાર કરો.મધ્યવર્તી પ્રમાણભૂત મંદન તરીકે 110 µg/L (110 ppb) BDDE ઉકેલ તૈયાર કરવા માટે આ ઉકેલનો ઉપયોગ કરો.પછી, 75, 50, 25, 10, અને 1 ppb ની ઇચ્છિત સાંદ્રતા હાંસલ કરવા માટે મધ્યવર્તી મંદનને ઘણી વખત પાતળું કરીને પ્રમાણભૂત વળાંક તૈયાર કરવા માટે મધ્યવર્તી BDDE પ્રમાણભૂત મંદન (110 ppb) નો ઉપયોગ કરો.આકૃતિ 1 માં બતાવ્યા પ્રમાણે, તે જોવા મળે છે કે 1.1 થી 110 ppb સુધીના BDDE પ્રમાણભૂત વળાંકમાં સારી રેખીયતા (R2>0.99) છે.પ્રમાણભૂત વળાંક ચાર સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાં પુનરાવર્તિત થયો હતો.
આકૃતિ 1 LC-MS વિશ્લેષણ દ્વારા મેળવેલ BDDE પ્રમાણભૂત કેલિબ્રેશન વળાંક, જેમાં સારો સહસંબંધ જોવા મળે છે (R2>0.99).
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી.
ક્રોસ-લિંક્ડ HA માં હાજર BDDE ધોરણો અને બેઝ સોલ્યુશનમાં BDDE ધોરણોને ઓળખવા અને પ્રમાણિત કરવા માટે, LC-MS વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
ક્રોમેટોગ્રાફિક વિભાજન LUNA 2.5 µm C18(2)-HST કૉલમ (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) પર પ્રાપ્ત થયું હતું અને વિશ્લેષણ દરમિયાન ઓરડાના તાપમાને (25°C) રાખવામાં આવ્યું હતું.મોબાઇલ તબક્કામાં 0.1% ફોર્મિક એસિડ ધરાવતા એસિટોનાઇટ્રાઇલ (દ્રાવક A) અને પાણી (દ્રાવક B) નો સમાવેશ થાય છે.મોબાઇલ તબક્કો ગ્રેડિયન્ટ ઇલ્યુશન દ્વારા ઇલ્યુટ થાય છે.ઢાળ નીચે મુજબ છે: 0 મિનિટ, 2% A;1 મિનિટ, 2% A;6 મિનિટ, 98% A;7 મિનિટ, 98% A;7.1 મિનિટ, 2% એ;10 મિનિટ , 2% A. ચાલવાનો સમય 10 મિનિટ છે અને ઈન્જેક્શન વોલ્યુમ 20 μL છે.BDDE નો રીટેન્શન સમય લગભગ 3.48 મિનિટ છે (પ્રયોગોના આધારે 3.43 થી 4.14 મિનિટ સુધીનો).LC-MS પૃથ્થકરણ માટે મોબાઇલ તબક્કો 0.25 mL/min ના પ્રવાહ દરે પમ્પ કરવામાં આવ્યો હતો.
MS દ્વારા BDDE પૃથ્થકરણ અને પ્રમાણીકરણ માટે, UPLC સિસ્ટમ (વોટર્સ) એ API 3000 ટ્રિપલ ક્વાડ્રપોલ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (AB SCIEX) સાથે ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયનાઇઝેશન સ્ત્રોતથી સજ્જ છે, અને વિશ્લેષણ હકારાત્મક આયન મોડ (ESI+) માં કરવામાં આવે છે.
BDDE પર કરવામાં આવેલા આયન ફ્રેગમેન્ટ વિશ્લેષણ મુજબ, સૌથી વધુ તીવ્રતા સાથેનો ટુકડો 129.1 Da (આકૃતિ 6) ને અનુરૂપ ટુકડો હોવાનું નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.તેથી, પ્રમાણીકરણ માટે મલ્ટિ-આયન મોનિટરિંગ મોડ (MIM) માં, BDDE નું માસ કન્વર્ઝન (માસ-ટુ-ચાર્જ રેશિયો [m/z]) 203.3/129.1 Da છે.તે LC-MS વિશ્લેષણ માટે સંપૂર્ણ સ્કેન (FS) મોડ અને પ્રોડક્ટ આયન સ્કેન (PIS) મોડનો પણ ઉપયોગ કરે છે.
પદ્ધતિની વિશિષ્ટતા ચકાસવા માટે, ખાલી નમૂના (પ્રારંભિક મોબાઇલ તબક્કો) નું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.203.3/129.1 Da ના સામૂહિક રૂપાંતરણ સાથે ખાલી નમૂનામાં કોઈ સંકેત મળ્યા નથી.પ્રયોગની પુનરાવર્તિતતાના સંદર્ભમાં, 55 ppb (કેલિબ્રેશન કર્વની મધ્યમાં) ના 10 પ્રમાણભૂત ઇન્જેક્શનનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું, જેના પરિણામે અવશેષ પ્રમાણભૂત વિચલન (RSD) <5% (ડેટા બતાવ્યો નથી).
શેષ BDDE સામગ્રીને ચાર સ્વતંત્ર પ્રયોગોને અનુરૂપ આઠ અલગ-અલગ ઑટોક્લેવ્ડ BDDE ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ્સમાં પરિમાણિત કરવામાં આવ્યું હતું."સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ" વિભાગમાં વર્ણવ્યા મુજબ, BDDE સ્ટાન્ડર્ડ ડિલ્યુશનના રીગ્રેસન કર્વના સરેરાશ મૂલ્ય દ્વારા જથ્થાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવે છે, જે 203.3/129.1 Da ના BDDE માસ ટ્રાન્ઝિશન પર શોધાયેલ અનન્ય શિખરને અનુરૂપ છે. 3.43 થી 4.14 મિનિટનો સમય રાહ જોતો નથી.આકૃતિ 2 10 ppb BDDE સંદર્ભ ધોરણનું ઉદાહરણ ક્રોમેટોગ્રામ બતાવે છે.કોષ્ટક 1 આઠ અલગ-અલગ હાઇડ્રોજેલ્સની શેષ BDDE સામગ્રીનો સારાંશ આપે છે.મૂલ્ય શ્રેણી 1 થી 2.46 ppb છે.તેથી, નમૂનામાં શેષ BDDE સાંદ્રતા માનવ ઉપયોગ માટે સ્વીકાર્ય છે (<2 ppm).
આકૃતિ 2 10 ppb BDDE સંદર્ભ પ્રમાણભૂત (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) સંક્રમણ 203.30/129.10 Da (પોઝિટિવ MRM મોડમાં) ના LC-MS વિશ્લેષણ દ્વારા મેળવેલ આયન ક્રોમેટોગ્રામ.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા દેખરેખ;MS, માસ;m/z, માસ-ટુ-ચાર્જ ગુણોત્તર.
નોંધ: નમૂનાઓ 1-8 ઓટોક્લેવ્ડ BDDE ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ્સ છે.હાઇડ્રોજેલમાં BDDE ની અવશેષ રકમ અને BDDE રીટેન્શન સમયની ટોચ પણ નોંધવામાં આવે છે.છેલ્લે, વિવિધ રીટેન્શન સમય સાથે નવા શિખરોનું અસ્તિત્વ પણ નોંધવામાં આવે છે.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;HA, હાયલ્યુરોનિક એસિડ;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા દેખરેખ;tR, રીટેન્શન સમય;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;RRT, સંબંધિત રીટેન્શન સમય.
આશ્ચર્યજનક રીતે, એલસી-એમએસ આયન ક્રોમેટોગ્રામના વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે તમામ ઓટોક્લેવ્ડ ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ નમૂનાઓના વિશ્લેષણના આધારે, 2.73 થી 3.29 મિનિટના ટૂંકા રીટેન્શન સમય પર વધારાની ટોચ હતી.ઉદાહરણ તરીકે, આકૃતિ 3 ક્રોસ-લિંક્ડ HA નમૂનાનું આયન ક્રોમેટોગ્રામ બતાવે છે, જ્યાં લગભગ 2.71 મિનિટના અલગ રીટેન્શન સમયે વધારાની ટોચ દેખાય છે.નવા અવલોકન કરેલ શિખર અને BDDE ના શિખર વચ્ચે અવલોકન કરેલ સંબંધિત રીટેન્શન ટાઈમ (RRT) 0.79 (કોષ્ટક 1) હોવાનું જણાયું હતું.કારણ કે આપણે જાણીએ છીએ કે LC-MS પૃથ્થકરણમાં ઉપયોગમાં લેવાતા C18 સ્તંભમાં નવા અવલોકન કરાયેલ શિખર ઓછા જાળવવામાં આવ્યા છે, નવી ટોચ BDDE કરતાં વધુ ધ્રુવીય સંયોજનને અનુરૂપ હોઈ શકે છે.
આકૃતિ 3 LC-MS (MRM માસ કન્વર્ઝન 203.3/129.0 Da) દ્વારા મેળવેલ ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ નમૂનાનું આયન ક્રોમેટોગ્રામ.
સંક્ષેપ: HA, હાયલ્યુરોનિક એસિડ;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા દેખરેખ;RRT, સંબંધિત રીટેન્શન સમય;tR, રીટેન્શન સમય.
અવલોકન કરાયેલા નવા શિખરો ઉપયોગમાં લેવાતા કાચા માલમાં મૂળ રૂપે હાજર દૂષકો હોઈ શકે તેવી શક્યતાને નકારી કાઢવા માટે, આ કાચા માલનું પણ એ જ એલસી-એમએસ વિશ્લેષણ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.વિશ્લેષણ કરાયેલ પ્રારંભિક સામગ્રીમાં પાણી, પાણીમાં 2% NaHA, પાણીમાં 1% NaOH, અને ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયામાં ઉપયોગમાં લેવાતી સમાન સાંદ્રતા પર BDDEનો સમાવેશ થાય છે.ઉપયોગમાં લેવાતી પ્રારંભિક સામગ્રીનો આયન ક્રોમેટોગ્રામ કોઈ સંયોજન અથવા શિખર બતાવતો નથી, અને તેનો રીટેન્શન સમય અવલોકન કરાયેલ નવા શિખરને અનુરૂપ છે.આ હકીકત એ વિચારને નકારી કાઢે છે કે માત્ર પ્રારંભિક સામગ્રીમાં કોઈપણ સંયોજનો અથવા પદાર્થો હોઈ શકે છે જે વિશ્લેષણ પ્રક્રિયામાં દખલ કરી શકે છે, પરંતુ અન્ય પ્રયોગશાળા ઉત્પાદનો સાથે સંભવિત ક્રોસ-પ્રદૂષણના કોઈ સંકેત નથી.BDDE અને નવા શિખરોના LC-MS વિશ્લેષણ પછી મેળવેલ સાંદ્રતા મૂલ્યો કોષ્ટક 2 (નમૂનાઓ 1-4) અને આકૃતિ 4 માં આયન ક્રોમેટોગ્રામમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.
નોંધ: નમૂનાઓ 1-4 ઓટોક્લેવ્ડ BDDE ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા કાચા માલસામાનને અનુરૂપ છે.આ નમૂનાઓ ઓટોક્લેવ્ડ ન હતા.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;HA, હાયલ્યુરોનિક એસિડ;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા મોનીટરીંગ.
આકૃતિ 4 HA અને BDDE ની ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયામાં ઉપયોગમાં લેવાતા કાચા માલના નમૂનાના LC-MS ક્રોમેટોગ્રામને અનુરૂપ છે.
નોંધ: આ બધાને સમાન સાંદ્રતા અને ગુણોત્તર પર માપવામાં આવે છે જેનો ઉપયોગ ક્રોસ-લિંકિંગ પ્રતિક્રિયા હાથ ધરવા માટે થાય છે.ક્રોમેટોગ્રામ દ્વારા પૃથ્થકરણ કરાયેલ કાચા માલની સંખ્યા આના અનુરૂપ છે: (1) પાણી, (2) 2% HA જલીય દ્રાવણ, (3) 1% NaOH જલીય દ્રાવણ.LC-MS વિશ્લેષણ 203.30/129.10 Da (પોઝિટિવ MRM મોડમાં) ના સામૂહિક રૂપાંતરણ માટે કરવામાં આવે છે.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;HA, હાયલ્યુરોનિક એસિડ;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા મોનીટરીંગ.
નવી શિખરોની રચના તરફ દોરી ગયેલી પરિસ્થિતિઓનો અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો હતો.ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલના ઉત્પાદન માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પ્રતિક્રિયાની પરિસ્થિતિઓ BDDE ક્રોસ-લિંકિંગ એજન્ટની પ્રતિક્રિયાશીલતાને કેવી રીતે અસર કરે છે તે અભ્યાસ કરવા માટે, નવા શિખરો (શક્ય આડ-ઉત્પાદનો) ની રચના તરફ દોરી જાય છે, વિવિધ માપન કરવામાં આવ્યા હતા.આ નિર્ધારણમાં, અમે અંતિમ BDDE ક્રોસલિંકરનો અભ્યાસ અને વિશ્લેષણ કર્યું, જેને જલીય માધ્યમમાં NaOH (0%, 1%, 0.1%, અને 0.01%) ની વિવિધ સાંદ્રતા સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ ઑટોક્લેવિંગ દ્વારા અથવા તેના વગર.સમાન પરિસ્થિતિઓનું અનુકરણ કરવાની બેક્ટેરિયા પ્રક્રિયા ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ બનાવવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ જેવી જ છે."સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ" વિભાગમાં વર્ણવ્યા મુજબ, નમૂનાના સામૂહિક સંક્રમણનું LC-MS દ્વારા 203.30/129.10 Da માં વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.BDDE અને નવા શિખરની સાંદ્રતાની ગણતરી કરવામાં આવે છે, અને પરિણામો કોષ્ટક 3 માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે. સોલ્યુશનમાં NaOH ની હાજરીને ધ્યાનમાં લીધા વિના, ઓટોક્લેવ્ડ ન હોય તેવા નમૂનાઓમાં કોઈ નવા શિખરો મળ્યાં નથી (નમૂના 1-4, કોષ્ટક 3).ઓટોક્લેવ્ડ નમૂનાઓ માટે, નવા શિખરો માત્ર દ્રાવણમાં NaOH ની હાજરીમાં જ શોધી કાઢવામાં આવે છે, અને ટોચની રચના દ્રાવણમાં NaOH સાંદ્રતા (નમૂનાઓ 5-8, કોષ્ટક 3) (RRT = 0.79) પર આધારિત હોય તેવું લાગે છે.આકૃતિ 5 એ આયન ક્રોમેટોગ્રામનું ઉદાહરણ બતાવે છે, જે NAOH ની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં બે ઓટોક્લેવ્ડ નમૂનાઓ દર્શાવે છે.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા મોનીટરીંગ.
નોંધ: ટોચનો ક્રોમેટોગ્રામ: નમૂનાને 0.1% NaOH જલીય દ્રાવણ અને ઓટોક્લેવ્ડ (20 મિનિટ માટે 120°C) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી.બોટમ ક્રોમેટોગ્રામ: નમૂનાની સારવાર NaOH સાથે કરવામાં આવી ન હતી, પરંતુ સમાન શરતો હેઠળ ઓટોક્લેવ કરવામાં આવી હતી.LC-MS દ્વારા 203.30/129.10 Da (પોઝિટિવ MRM મોડમાં) ના સામૂહિક રૂપાંતરણનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા મોનીટરીંગ.
બધા ઓટોક્લેવ્ડ નમૂનાઓમાં, NaOH સાથે અથવા તેના વિના, BDDE સાંદ્રતામાં ઘણો ઘટાડો થયો હતો (16.6 વખત સુધી) (નમૂનાઓ 5-8, કોષ્ટક 2).BDDE સાંદ્રતામાં ઘટાડો એ હકીકતને કારણે હોઈ શકે છે કે ઊંચા તાપમાને, પાણી 1,2-diol સંયોજન બનાવવા માટે BDDE ની ઇપોક્સાઇડ રિંગ ખોલવા માટે આધાર (ન્યુક્લિયોફાઇલ) તરીકે કાર્ય કરી શકે છે.આ સંયોજનની મોનોસોટોપિક ગુણવત્તા BDDE કરતા અલગ છે અને તેથી તેની અસર થશે નહીં.LC-MS એ 203.30/129.10 Da ની સામૂહિક પાળી શોધી કાઢી.
છેવટે, આ પ્રયોગો દર્શાવે છે કે નવા શિખરોનું નિર્માણ BDDE, NAOH અને ઑટોક્લેવિંગ પ્રક્રિયાની હાજરી પર આધાર રાખે છે, પરંતુ HA સાથે કોઈ લેવાદેવા નથી.
અંદાજે 2.71 મિનિટના રીટેન્શન સમયે મળી આવેલ નવું શિખર LC-MS દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું હતું.આ હેતુ માટે, BDDE (9.9 mg/mL) ને 1% NaOH જલીય દ્રાવણમાં ઉકાળવામાં આવ્યું હતું અને ઓટોક્લેવ કરવામાં આવ્યું હતું.કોષ્ટક 4 માં, નવા શિખરની લાક્ષણિકતાઓ જાણીતી BDDE સંદર્ભ ટોચ સાથે સરખાવવામાં આવી છે (રિટેન્શન સમય આશરે 3.47 મિનિટ).બે શિખરોના આયન ફ્રેગમેન્ટેશન પૃથ્થકરણના આધારે, તે નિષ્કર્ષ પર આવી શકે છે કે 2.72 મિનિટના રીટેન્શન સમય સાથેનું શિખર BDDE શિખર જેવા જ ટુકડાઓ દર્શાવે છે, પરંતુ વિવિધ તીવ્રતા સાથે (આકૃતિ 6).2.72 મિનિટના રીટેન્શન ટાઇમ (PIS) ને અનુરૂપ શિખર માટે, 147 Da ના સમૂહ પર વિભાજન પછી વધુ તીવ્ર શિખર જોવામાં આવ્યું હતું.આ નિર્ધારણમાં ઉપયોગમાં લેવાતી BDDE સાંદ્રતા (9.9 mg/mL) પર, અલ્ટ્રાવાયોલેટ સ્પેક્ટ્રમમાં વિવિધ શોષણ સ્થિતિઓ (UV, λ=200 nm) પણ ક્રોમેટોગ્રાફિક વિભાજન પછી જોવામાં આવી હતી (આકૃતિ 7).2.71 મિનિટના રીટેન્શન ટાઈમ સાથેનું શિખર હજી પણ 200 એનએમ પર દૃશ્યમાન છે, જ્યારે BDDE શિખર સમાન પરિસ્થિતિઓમાં ક્રોમેટોગ્રામમાં અવલોકન કરી શકાતું નથી.
કોષ્ટક 4 લગભગ 2.71 મિનિટના રીટેન્શન ટાઈમ સાથે નવા શિખર અને 3.47 મિનિટના રીટેન્શન ટાઈમ સાથે BDDE પીકના લાક્ષણિકતા પરિણામો
નોંધ: આ પરિણામો મેળવવા માટે, LC-MS અને HPLC વિશ્લેષણ (MRM અને PIS) બે શિખરો પર કરવામાં આવ્યા હતા.HPLC વિશ્લેષણ માટે, 200 nm ની તરંગલંબાઇ સાથે UV શોધનો ઉપયોગ થાય છે.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;HPLC, ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા દેખરેખ;m/z, માસ-ટુ-ચાર્જ ગુણોત્તર;PIS, ઉત્પાદન આયન સ્કેનિંગ;અલ્ટ્રાવાયોલેટ પ્રકાશ, અલ્ટ્રાવાયોલેટ પ્રકાશ.
નોંધ: સામૂહિક ટુકડાઓ LC-MS વિશ્લેષણ (PIS) દ્વારા મેળવવામાં આવે છે.ટોપ ક્રોમેટોગ્રામ: BDDE સ્ટાન્ડર્ડ નમૂનાના ટુકડાઓનું માસ સ્પેક્ટ્રમ.બોટમ ક્રોમેટોગ્રામ: શોધાયેલ નવા શિખરનું માસ સ્પેક્ટ્રમ (BDDE પીક સાથે સંકળાયેલ RRT 0.79 છે).BDDE ને 1% NaOH સોલ્યુશનમાં પ્રક્રિયા કરવામાં આવી હતી અને ઓટોક્લેવ કરવામાં આવી હતી.
સંક્ષેપ: BDDE, 1,4-બ્યુટેનેડિઓલ ડિગ્લિસિડિલ ઈથર;એલસી-એમએસ, લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી;MRM, બહુવિધ પ્રતિક્રિયા દેખરેખ;PIS, ઉત્પાદન આયન સ્કેન;RRT, સંબંધિત રીટેન્શન સમય.
આકૃતિ 7 203.30 Da પૂર્વવર્તી આયનનો આયન ક્રોમેટોગ્રામ, અને (A) 2.71 મિનિટના રીટેન્શન સમય સાથેનું નવું શિખર અને (B) 200 nm પર 3.46 મિનિટ પર BDDE સંદર્ભ પ્રમાણભૂત શિખરનું UV શોધ.
ઉત્પાદિત તમામ ક્રોસ-લિંક્ડ HA હાઇડ્રોજેલ્સમાં, એવું જોવામાં આવ્યું હતું કે એલસી-એમએસ પરિમાણ પછી શેષ BDDE સાંદ્રતા <2 પીપીએમ હતી, પરંતુ વિશ્લેષણમાં એક નવી અજ્ઞાત ટોચ દેખાઈ હતી.આ નવી ટોચ BDDE માનક ઉત્પાદન સાથે મેળ ખાતી નથી.BDDE સ્ટાન્ડર્ડ પ્રોડક્ટ પણ એ જ ગુણવત્તા રૂપાંતરણ (MRM કન્વર્ઝન 203.30/129.10 Da) વિશ્લેષણમાંથી સકારાત્મક MRM મોડમાં પસાર થયું છે.સામાન્ય રીતે, અન્ય વિશ્લેષણાત્મક પદ્ધતિઓ જેમ કે ક્રોમેટોગ્રાફીનો ઉપયોગ હાઇડ્રોજેલ્સમાં BDDE શોધવા માટે મર્યાદા પરીક્ષણો તરીકે થાય છે, પરંતુ મહત્તમ શોધ મર્યાદા (LOD) 2 પીપીએમ કરતાં થોડી ઓછી છે.બીજી બાજુ, અત્યાર સુધી, NMR અને MS નો ઉપયોગ ક્રોસ-લિંકિંગ અને/અથવા HA ના ફેરફારની ડિગ્રીને દર્શાવવા માટે કરવામાં આવ્યો છે.આ તકનીકોનો ઉદ્દેશ્ય આ લેખમાં વર્ણવ્યા મુજબ આટલી ઓછી સાંદ્રતા પર અવશેષ BDDE શોધને માપવાનો ક્યારેય ન હતો (અમારી LC-MS પદ્ધતિ = 10 ppbનો LOD).